chirurdzy przemyśl ad

Obecność zespołu klinicznego identycznego jak w przypadku napadowej nocnej hemoglobinurii sugeruje, że HRF20 jest ważny w utrzymaniu integralności krwinek czerwonych in vivo. Metody
Cierpliwy
Pacjentem jest 22-letni mężczyzna z przerywaną bladością i krwiomoczem przez 9 lat. W wieku 13 lat miał epizod niedokrwistości hemolitycznej i hemoglobinurię, kiedy postawiono mu diagnozę napadowej nocnej hemoglobinurii33. W kolejnych dziewięciu latach testy hemolizy Hisa i sacharozy były zawsze dodatnie i wystąpiło dziewięć epizodów hemolizy, z zawał mózgu podczas trzeciego i dziewiątego epizodu. Jego ojciec i matka są kuzynami, ale nie ma też historii niedokrwistości hemolitycznej ani hemoglobinurii.
Przygotowanie krwi obwodowej
Próbki krwi od pacjenta, jego rodziców i pięciu niespokrewnionych zdrowych osobników zebrano w heparynie. Próbki odwirowano, osocze i kożuszek leukocytarny usunięto, a erytrocyty odzyskano. Granulocyty odzyskano z osocza i kożuszka leukocytarnego przez sedymentację w 6% dekstranu przez 60 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odwirowanie w gradiencie Ficoll-Conray. Wszelkie zanieczyszczające erytrocyty usunięto przez dwa cykle hipotonicznej lizy. Erytrocyty i granulocyty przemyto i zawieszono w stężeniu 4 x 107 komórek na mililitr w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem zawierającej 1% albuminy surowicy bydlęcej i 0,1% azydku sodu (pH 7,4) (PBS-BSA).
Przeciwciała
Zastosowane przeciwciała były przeciwciałem monoklonalnym anty-HRF20 (1F5), 21 trzema przeciwciałami monoklonalnymi anty-DAF (IA10, IIH6 i VIIIA7), 34 dwoma przeciwciałami monoklonalnymi anty-acetylocholinoesterazy (AE1 i AE2, uzyskanymi z American Type Culture Collection, Rockville, Md.), 35 i przeciwciało monoklonalne anty-LFA-3 (TS2 / 9, dostarczone przez Dr. Y. Takai, Uniwersytet Osaka) .36 Mieszanina niepowiązanych mysich przeciwciał monoklonalnych, D031A7HP i R16.7,37 była stosowany jako dopasowana pod względem izotypu kontrola negatywna. Jako drugie przeciwciało do sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie, skoniugowane z fluoresceiną izotiocyjanianowe kozie F (ab ) 2 anty-mysie IgG otrzymano z Cappel Laboratories (Piscataway, NJ). Kozie antimouse IgG do badań immunohistochemicznych, które zostały poddane immunoadsorpcji w fazie stałej w celu zapobiegania reaktywności krzyżowej z ludzką IgG, otrzymano z Silenus Laboratories (Hawthorn, Victoria, Australia) i biotynylowano jak opisano w innym miejscu38.
Analiza sortowania komórek
W przypadku sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie, 25 .l komórek (4 × 107 komórek na mililitr) inkubowano przez 30 minut na lodzie z 25 .l mieszaniny trzech przeciwciał anty-DAF (10 .g każdego z IA10, IIH6 i VIIIA7 na mililitr PBS-BSA), 25 .l anty-HRF20 (5 .g 1F5 na mililitr PBS-BSA), 25 .l mieszaniny dwóch przeciwciał anty-acetylocholinesterazy (AE1 i AE2, każdy w stosunku 1:10 rozcieńczenie w płynie puchlinowym w PBS-BSA) lub 25 ul anty-LFA-3 (TS2 / 9, nierozcieńczony supernatant hodowli); oraz z 25 .l mieszaniny dwóch niespokrewnionych przeciwciał (10 .g na mililitr PBS-BSA) jako kontroli negatywnej. Traktowane komórki przemyto dwukrotnie, ponownie zawieszono w 25 .l PBS-BSA i zmieszano z równą objętością rozcieńczonego 1:10 korzenia antyutleniacza IgG z fluoresceiny izotiocyjanianem.
[więcej w: wiązki przewodzące, praca dla anestezjologów, miękisz drzewny ]