chirurdzy przemyśl cd

Po inkubacji przez 30 minut na lodzie i dokładnym przemyciu komórki analizowano za pomocą sortera komórek FacScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Przygotowanie tkanek skóry i biopsji oraz badań immunohistochemicznych
Tkanki skórne uzyskano od pacjenta i pięciu normalnych osobników za pomocą biopsji, mimo że wszyscy wyrazili świadomą zgodę. Każda próbka została podzielona na dwie części. Jedna porcja została szybko zamrożona w ciekłym azocie i przechowywana w -80 ° C do momentu użycia. Drugą hodowano w minimalnej pożywce Eagle, zawierającej 10 procent płodowej surowicy cielęcej w celu wytworzenia hodowli fibroblastów.
Hodowane fibroblasty i zamrożone tkanki skóry barwiono anty-DAF (IA10) i anty-HRF20 (1F5) zgodnie z metodą ABC (avidin-biotyna-peroksydaza). Ponieważ limfocyty B wyrażają HRF2021 i DAF, przeprowadzono 34 badania z użyciem tkanek migdałkowych w celu ustalenia optymalnych warunków wykrywania DAF i HRF20 w fibroblastach i zamrożonych tkankach skóry. Fibroblasty w pożywce hodowlanej przemyto trzykrotnie solanką buforowaną fosforanem (pH 7,2), utrwalono w acetonie zawierającym 2% paraformaldehydu w 4 ° C przez 10 minut, suszono na powietrzu i płukano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem w 4 ° C przez noc. Zamrożone tkanki pocięte na 3-.m przekroje suszono powietrzem, utrwalano w acetonie zawierającym 2% paraformaldehydu w -20 ° C przez 10 minut, a następnie w acetonie w -20 ° C przez 2 minuty, suszono na powietrzu i płukano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem w 4 ° C przez noc. Metodę ABC przeprowadzono jak opisano poprzednio.39 Wstępnie pobrane próbki inkubowano z anty-DAF (IA10, 5 .g na mililitr) i anty-HRF20 (1F5, 2 .g na mililitr) przez 50 minut w temperaturze pokojowej, a następnie z biotynylowanym kozie antimouse IgG przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Po potraktowaniu próbek potraktowanych roztworem soli buforowanym fosforanem, inkubowano je z ABC (standardowy zestaw ABC, Vector Laboratories, Burlingame, CA) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Reakcję peroksydazy wywoływano przez pięć minut za pomocą 30 mg 3,3 -diaminobenzydyny w 100 ml 0,05 M buforu TRIS-kwas solny (pH 7,6) zawierającego 0,01% nadtlenku wodoru. Negatywne kontrole dla metody ABC przygotowano przez pominięcie pierwszych przeciwciał i użycie surowicy mysiej jako pierwszej warstwy.
Wyniki
Analiza sortowania komórek
Rysunek 1. Rysunek 1. Ekspresja powierzchniowa HRF20, DAF, acetylocholinoesterazy i LFA-3 na erytrocytach od pacjenta, jego rodziców i osób zdrowych w analizie komórek z komórkami aktywowanymi fluorescencyjnie. Barwienie HRF20, DAF, acetylocholinesterazy i LFA-3 i następującą analizę komórek-sorter przeprowadzono zgodnie z opisem w Methods. Ekspresja HRF20 nie była obserwowana na erytrocytach od pacjenta i została zmniejszona w stosunku do jego matki i ojca. Ekspresja DAF, acetylocholinesterazy i LFA-3 na komórkach od pacjenta i jego rodziców była taka sama jak w komórkach od zdrowych osób. Wyniki analizy powierzchniowej ekspresji DAF u pacjenta zostały wcześniej opisane33. Złamane krzywe oznaczają ekspresję na komórkach barwionych niespokrewnionymi (kontrolnymi) przeciwciałami monoklonalnymi.
FL1 oznacza intensywność 1.
Rysunek 2
[przypisy: ggtp normy, rodzaje ściegów, neoplazja ]